Przygotowanie próbki do pomiarów przy pomocy mikroskopii AFM nie jest skomplikowane. Jednak jakość uzyskanego później obrazu bardzo zależy od tej czynności. Występują tu ograniczenia co do wymiarów, konsystencji i kształtu próbki.
Mikroskopem AFM można badać tylko ciała stałe, może się to odbywać w powietrzu lub w cieczy. Warunkiem koniecznym prawidłowego skanowania jest to, aby badany materiał był solidnie umocowany do podłoża, tak by igła nie mogła go przesuwać. Nie można badać substancji, które przybierają kształt naczynia, w którym się znajdują. Twardość próbki ma zasadnicze znaczenie, można badać substancje miękkie, ale tylko do pewnych granic.
Przydatność próbki do skanowania można stwierdzić tylko podczas faktycznego pomiaru. Istnieją substancje, których badanie mikroskopem AFM jest utrudnione lub niemożliwe. Możliwe jest skanowanie proszków.
Próbka jest umieszczana na metalowym krażku o średnicy 15 mm i przymocowana jest przy pomocy przewodzącej elektrycznie, dwustronnej taśmy samoprzylepnej.
Najładniejsze obrazy uzyskamy, gdy badana substancja jest naniesiona na miniaturowe szkiełko (10 x 10 mm) a nierównomierność powierzchni wynosi mniej niż 100 nm.
Ze względu na budowę głowicy mikroskopu powierzchnia, która może być objęta skanowaniem, umieszczona jest centralnie na próbce, a jej rozmiar obejmuje 1,5 x 1,5 mm2. Nie można więc skanować obszarów położonych na brzegach próbki.